Retourné en France le 2 septembre 1534, sans or ni métaux, il reçoit dès le 30 octobre de cette même année une nouvelle mission lui demandant de traverser l'océan de la part de François 1er. Pour cette nouvelle expédition, il part avec trois navires et quelque 110 hommes, alors qu'au premier voyage il n'est parti qu'avec deux navires et 61 hommes. La Grande Hermine, la Petite Hermine et l'Émérillon partent de Saint-Malo le 19 mai 1535. Cartier et son équipage arrivent en Amérique environ 50 jours après leur départ. Il reprend tout de suite ses recherches en longeant la Côte Nord. Pour marquer son passage, il plante une croix dans un havre à l'ouest de Natashquan. Il s'arrête dans une baie qu'il nomme Saint-Laurent (aujourd'hui Sainte-Geneviève) dont le nom s'étendra au golfe puis au fleuve. Le 13 août, Cartier franchit une étape capitale. Suite à l'indication de deux indigènes, il apprend la géographie du pays. « Le fleuve qui va se resserrant à mesure que l'on avance; de salée, son eau devient douce et provient de si loin que l'on a pas de souvenance qu'un homme en ait vu la source.» Enfin, le passage dont Cartier était à la recherche.

En examinant les deux rives du fleuve, Cartier se met à le remonter. Il aperçoit à sa droite une rivière « fort parfonde et courante » de laquelle ces guides Amérindiens affirmaient être le chemin du Saguenay, là où l'on retrouve du cuivre. Le 7 septembre, Cartier arrive à l'archipel d'Orléans qui est « le commencement de la terre et provynce de Canada.» Suite aux festivités avec Donnacona, Cartier choisit de se fixer sur la rivière Sainte-Croix (Saint-Charles). En face s'élevait le cap de Stadaconé, site d'une bourgade influencée par la mode montagnaise, bien qu'elle soit habitée par des Iroquois.

Cartier est impatient de se rendre à Hochelaga (Montréal) mais les deux interprètes indigènes ont déjà commencé à comploter contre les Français. Donnacona veut s'assurer du monopole du commerce qui va s'organiser, dans l'espoir d'échapper à la pression continuelle exercée par Hochelaguiens sur les Stadaconiens. Par des présents, puis par une mise en scène de sorcellerie, Donnacona tente de retenir Cartier. Sans interprète, élément qui diminuera grandement l'utilité du voyage, celui-ci à bord de l'Émérillon quitte Stadaconé le 19 septembre. S'arrêtant dans la région de Portneuf, il forge une alliance avec le chef de ce lieu, jaloux et ennemi de Donnacona. Parvenu au lac qu'il nomme Angoulême (Saint-Pierre), il laisse son navire à l'ancre et continue en barque avec une trentaine d'hommes pour enfin arriver à Hochelaga le 2 octobre. Cette ville est close et fortifiée, et vit à la mode iroquoise. Il reçoit une joyeuse réception de la part des Iroquois laurentiens qu'il considère comme une forme de cérémonie religieuse. Sans s'attarder davantage, il visite le saut qui, à l'ouest, bloque la navigation (rapides de Lachine). Les Amérindiens lui expliquent, par des signes, que d'autres sauts barrent la rivière et qu'un cours d'eau, par où on peut atteindre l'or, l'argent et le cuivre du Saguenay s'y jette par le nord (rivière des Outaouais). Il quitte Hochelaga le lendemain. Le 7 octobre, il plante une croix à l'embouchure de la rivière Fouez (Saint-Maurice).

-Hochelaga -